При покупке микроскопа стоит задуматься о приобретении дополнительных аксессуаров. Предметные и покровные стекла, пипетка, острый нож и иммерсионное масло - вот основные составляющие необходимого набора. Но не менее важны и микропрепараты. Особенно если прибор предназначается для ребенка. В наборе микропрепаратов находятся полностью подготовленные образцы материалов для исследования. Их очень удобно применять и легко устанавливать на предметный столик. Но когда все представленные предметы будут изучены, исследования становятся скучными, поэтому мы советуем готовить микропрепараты самостоятельно.
Легко можно получить временный
микропрепарат, срезав кожицу лука или добыв каплю крови.
Сроки хранения таких образцов невелики, поэтому нужно
научиться "консервировать" их. Для этих целей используется
«канадский» бальзам, глицерин с желатином или целлоидин.
Одно из этих веществ наносится на покровное стекло и
склеивается с предметным.
Чтобы изучать жизнь простейших в капле воды, необходимо ее
разместить в стекле с выемкой, обработав его предварительно
кипящим содовым раствором (на 1 литр воды чайная ложка
соды), кипятить необходимо не менее 15 минут. Стеклышко
вытереть досуха, затем пипеткой поместить туда коплю воды из
водоема или аквариума и волокна ваты, чтобы утруднить
движение простейших. Покровное стекло предварительно нужно
обработать парафином либо вазелином, а потом наложить его на
предметное.
Можно взять и обычное стекло, без углубления. Обработать его пчелиным воском, в центр положить несколько волокон ваты, каплю воды и все плотно покрыть стеклом, не допуская попадания воздуха. Получится эффект "раздавленной капли". И в первом, и во втором случае образуется воздухонепроницаемое приспособление, в котором жидкость долго не будет испаряться.
Для более детального изучения микропрепараты допускается окрасить, при этом необходимо выбирать специальные нетоксичные красители. Достоверные результаты дают нейтральный красный в соотношении не более 1 к 200 000 и неконцентрированный щелочной раствор конго красного.
Во время исследования жизнедеятельности простейших в микропрепаратах важным фактором остается освещение. Оно должно быть специфическим. Поле зрения необходимо затемнять. Прямой луч света не позволяет рассмотреть все важные детали. Исследование стоит начинать с настройки микроскопа в режиме малого увеличения при суженной диафрагме. Затем, манипулируя объективом и фокусировочным механизмом, увеличивать картинку.
Но простое увеличение микропрепаратов с помощью объектива не всегда дает полную информацию об образце. В таком случае необходимо применять специальное иммерсионное масло. Оно значительно повышает разрешающую способность линзы.
Различают несколько видов иммерсии. Черным кольцом на объективе обозначается масляная, белым - водная, глицериновая - желтым, монобромнафталиновая иммерсия – красным. Масляная и водная импрессии наиболее распространенные, обычно применяются при проведении опытов по биологии. В итоге получаются наиболее достоверные результаты. После применения масел объектив необходимо протереть лоскутком специальной батистовой ткани, смоченной в специальное вещество для чистки объективов. Остальные виды объективов протирать запрещается!
Касторовое, вазелиновое, оливковое масло не стоит применять для увеличения разрешения. Эффективными являются исключительно иммерсионные. Благодаря их высокой величине преломления появляется возможность рассмотреть мельчайшие детали. Некачественные масла могут повредить линзу.
Для изготовления постоянного
микропрепарата хорошо подходит глицерин-желатин. Вот как
можно его приготовить. Замочить на сутки 10 г желатина в
воде. Затем переместить его на водяную баню и, равномерно
помешивая, ввести в него 15 г глицерина и карболовую кислоту
или формалин (2-3 капли). Процедить полученную смесь и
закрыть в герметичный сосуд. При необходимости раствор
разогревают и заливают им обработанные спиртом
микропрепараты, срок хранения которых после этого может
составлять несколько лет.
Овладев техникой создания микропрепаратов препаратов, можно
создавать собственные коллекции образцов.
Для тех, кто только начинает познавать микромир, мы рекомендуем приобрести уже готовый набор микропрепаратов Альтами, который включает в себя 40 образцов растительного и животного миров. Среди всего остального, в нем вы найдете самые популярные микропрепараты: кожицу лука, срез ветки липы, плесень, срезы органов, кровяных сосудов, костные клетки человека и животных, частички различных насекомых. Такое богатство самому раздобыть очень непросто, а иногда и невозможно.
Научившись изготавливать микропрепараты самостоятельно, вы сможете успешно пополнять набор Альтами новыми образцами.
Министерство образования и науки РФ
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Шадринский государственный педагогический институт»
Кафедра естественнонаучных дисциплин с методикой преподавания
Способы приготовления микропрепаратов по биологии
по специальности 050102 «Биология»
Исполнитель:
Горшкова Екатерина Андреевна
Студентка 3 курса дневного отделения
Научный руководитель:
Кандидат биологических наук, доцент
Шарыпова Надежда Владимировна
_________________________________
Оценка __________________________
Шадринск
2014
Введение ………………………………………………………………………….3
§ 1. Характеристика микропрепаратов и их использование ………………….4
§ 2. Оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов …….7
§ 3. Подготовка материала для приготовления микропрепаратов …………...12
§ 4. Способы приготовления микропрепаратов ……………………………….17
Заключение ………………………………………………………………………31
Библиографический список …………………………………………………….32
Приложение ……………………………………………………………………...34
Введение
Актуальность темы исследования . Микропрепараты являются наглядным средством обучения и поэтому их широко используют на уроках биологии во время лабораторных занятий, при изучении нового материала, обобщениях, сопоставлениях и опросе.
В связи с недостаточным обеспечением кабинетов биологии готовыми микропрепаратами, которые необходимы для лучшего изучения предмета, их можно изготовить самостоятельно.
Исходя из актуальности, мы выбрали следующую тему исследования: «Способы приготовления микропрепаратов по биологии».
Объектом исследования являются микропрепараты.
Предмет способы приготовления микропрепаратов.
Цель исследования : изучить виды микропрепаратов по биологии и способы их приготовления.
Задачи исследования:
- Изучить и проанализировать литературу по данной теме.
- Дать характеристику микропрепаратов и советы по их использованию на уроках биологии.
- Описать оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов.
- Научиться подготавливать материал для приготовления микропрепаратов.
- Изучить способы приготовления микропрепаратов.
Для реализации целей и задач использовали следующие методы исследования: анализ научно-методической литературы по теме исследования, опытно-поисковая работа и обобщение ее результатов.
Структура курсовой работы . Курсовая работа состоит из введения, 4 параграфов и заключения, представлен библиографический список, включающий 16 источников, 1 приложения.
§ 1. Характеристика микропрепаратов и их использование
К натуральным препарированным пособиям относятся гербарии, влажные препараты, микропрепараты.
Микропрепарат, представляет собой тонкий срез органа живого организма или микрочастицу, заключенный в прозрачный бальзам (иммерсионное масло) или высушенный, помещенный между двумя стеклами (предметным и покровным) .
Происхождение микропрепаратов берет начало в использовании слоновой кости или обычной кости в качестве подставки под образцы, которые помещались между дисками прозрачной слюды. Подобная конструкция была популярной в викторианской Англии, пока Королевское Микроскопическое Общество не представило стандартизированное предметное стекло для микроскопа .
Микропрепараты позволяют демонстрировать внутреннее клеточное строение организмов, что помогает формированию у учащихся знаний о едином клеточном строении организмов. Микропрепараты можно разделить на две группы:
- постоянные, изготовленные фабричным путем специально для обучения;
- временные, приготовленные учителем для урока или на уроке самими школьниками однократного пользования.
Постоянные микропрепараты представляют собой тончайшие срезы тканей организмов, их органов. Клетки в большинстве своем не имеют окраски и потому, даже при большом увеличении микроскопа, бывает трудно рассмотреть внутриклеточные структуры, в том числе ядро. В связи с этим клеточные микропрепараты окрашивают специальными красителями для придания им большей наглядности. Учителям обязательно надо предупреждать детей о том, что цвет не является естественным для микроструктур. Используют их при изучении нового материала, обобщениях, сопоставлениях и опросе.
Временные препараты так называются потому, что не сохраняются долго. После ознакомления с микрообъектом временный препарат смывается с предметного стекла. Приготовление микропрепарата - один из обязательных видов умений, формируемых в курсе биологии, начиная с 6 класса .
Для изучения живых клеток микроорганизмов применяют препараты “раздавленная капля”, “висячая капля”, “отпечаток”, “агаровая пленка” (“микрокультура”). Препараты живых клеток рассматривают с “сухими системами ” микроскопа. Препараты, работа с которыми уже закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе .
Микропрепараты позволяют проводить широкий ряд опытов, предусмотренных программой школьного курса биологии. Они предназначены для детального изучения микроскопических структур под микроскопом.
Преподаватель до работы с микропрепаратом должен четко объяснить учащимся, что они должны увидеть, используя таблицы, рисунки, схемы и т. п.
Во время опроса преподаватели нередко используют «немые», (без этикеток) микропрепараты. Учащимся дается задание определить микропрепараты, рассказать о строении той или иной ткани. Целесообразно хранить одинаковые микропрепараты в одной упаковке, чтобы можно было быстро раздать их учащимся.
Микропрепараты хранят вдали от отопительных приборов и так, чтобы предметное стекло находилось в горизонтальном положении для предотвращения «сползания» микропрепарата .
Требования к микропрепаратам:
- Стекла должны быть бесцветными и прозрачными. Покровное стекло должно быть тоньше предметного, которое служит основой изделия.
- Микропрепарат должен быть центрирован, т.е. расположен в середине покровного стекла. Местоположение очень мелкого объекта должно быть отмечено рамкой.
- Микроскопические срезы должны быть очень тонкими и иметь все необходимые для изучения элементы.
- Отдельные ткани микропрепарата должны быть окрашены ярким стойким красителем.
- Микропрепараты должны выпускаться в виде набора для каждого раздела курса биологии. Количество одноименных препаратов в наборе должно быть достаточным для проведения лабораторной работы всеми обучающимися в классе (15-20 шт.).
- К набору микропрепаратов должны быть приложены методические рекомендации, где должны быть приведены рисунки изучаемых микрообъектов и задания для самостоятельной работы учащихся .
Изучение микропрепаратов в процессе обучения приобщает к методам науки, дает возможность путем непосредственного наблюдения увидеть строение организмов, их частей.
Микропрепараты представляют собой микроскопически малые живые объекты, тончайшие срезы их органов и частей. Эти объекты заключены между покровным и предметным стеклами в специальном растворе. Для лучшей различимости препараты окрашивают, поэтому окраска объектов искусственная.
1. Да начала работы с микропрепаратом требуется записать его название, тему лабораторного занятия.
2. Изучение любого микропрепарата начинают с рассматривания под микроскопом при малом увеличении (56х). Затем выбирают место, где детали лучше видны, и ставят большое увеличение (120-300х) и приступают к зарисовке. При зарисовке микропрепарата надо соблюдать соотношение размерах отдельных частей оригинала. Зарисовка помогает лучше запомнить и создать зрительное представление об объекте.
3. Сначала на рисунке обозначают основные элементы, затем дополняют деталями. Под рисунком подписывают название микропрепарата и увеличение, при котором выполнен рисунок. На одной странице ученической тетради делают 2-3 рисунка. Основные структуры микропрепарата обозначают указателями и напротив каждой пишут цифру с последующей их расшифровкой. Контур поля зрения микроскопа не обозначают .
Таким образом, существует 2 вида микропрепаратов временные и постоянные. Их отличие состоит во времени хранения и способах приготовления. Микропрепараты должны отвечать определенным требованиям, которые необходимо тщательно соблюдать. Для приготовления микропрепаратов необходимо специальное оборудование, которое описано в следующем параграфе.
§ 2. Оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов
Рабочий стол.
При отсутствии специального стола с успехом может быть приспособлен любой стол (желательно с ящиками) с площадью рабочей поверхности не менее 60*120см.
Если крышка стола не имеет специального покрытия, то его следует сделать из какого-либо влагоустойчивого материала. Однако участок стола, предназначенный для непосредственной работы по приготовлению препаратов, в любом случае необходимо накрыть стеклом и расположить под ним небольшие (9*12см) листы белой или черной бумаги. Этим создается соответствующий фон, облегчающий работу с окрашенными (белый лист) и не окрашенными (черный лист) объектами. Рекомендуется также на оба листа нанести контуры предметного стекла с обозначением места расположения и размеров покровного стекла.
Для того, что бы удобнее расположить необходимое оборудование, следует иметь двухъярусную полку для реактивов, растворов и посуды, которая устанавливается либо перед работающим (вдоль заднего края стола), либо сбоку в зависимости от расположения стола относительно источника света.
Лабораторная посуда.
Широкогорлые банки с притертыми пробками различной вместимости от 50 до 200 мл используют для составления гистологических батарей, предназначенных для подготовки кусочков тканей к заливке различными средами. Более крупные банки применяют для фиксации и хранения кусочков тканей в фиксирующих жидкостях, обработки предметных стекол, приготовление нейтрального формалина и пр.
В место банок с притертыми пробками можно использовать небольшие хозяйственные банки с жестяными завинчивающимися крышками, разного объема.
Бюксы небольшие круглые стеклянные стаканчики различного диаметра и высоты с шлифованными крышками.
Биологические стаканчики круглые, овальные или четырехугольные (как и высокие бюксы) применяют для проводки гистологических срезов, монтированных на предметных стеклах. Для придания устойчивости и обеспечения порядка в расстановке их помещают в специальные стойки, изготовленные из дерева или пластмассы, по несколько штук в ряд в зависимости от методики обработки.
Чашки Петри широкие, плоские стеклянные чашки с крышками пригодны для различных манипуляций (окраска свободно плавающих и наклеенных на предметные стекла срезов, использование в качестве подставок под бюксы и т.д.).
Мерная посуда цилиндры и мензурки различной емкости (от 10 до 250-500 мл) воронки различных размеров.
Химические стаканчики круглые стеклянные стаканчики без крышек вместимостью 50-100 мл находят широкое применение при проведении гистохимических реакций, окраски срезов наклеенных на стекла и т.д.
Колбы (плоскодонные) вместимостью от 50 мл до 2 л. Малые колбы применяют для приготовления и хранения растворов различных красителей, большие под дистиллированную воду и прочие жидкости, расходуемые в больших количествах.
Пипетки обычные (предназначенные для закапывания лекарств) используют для накапывания на срезы красителей и различных жидкостей, градуированные (вместимостью 0,1-100 мл) применяют для отмеривания малых количеств различных жидкостей. Можно использовать в настоящее время широко используемые автоматические пипетки различной вместительности.
Предметные стекла прямоугольные пластины размером 76*25 мм толщиной 1,2-1,4 мм, предназначенные для размещения срезов в процессе приготовления микропрепаратов . Более толстые стекла не позволяют получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата, так как оно оказывается в толще стекла, а это нарушает фокусировку конденсора и резко снижает четкость изображения .
Покровные стекла представляют собой тонкие (0,15-0,17 мм толщины, более толстые стекла ухудшают качество изображения) пластинки различных размеров. Служат для покрытия обработанных срезов, расположенных на предметных стеклах. Размеры покровных стекол выбирают в зависимости от площади объекта.
Инструменты.
Инструменты, используемые в гистологической лаборатории, включают в себя пинцеты, скальпели, кровоостанавливающие зажимы, корнцанг, бактериологические петли шпатели, препаровальные иглы прямые и изогнутые, металлические и стеклянные. Стеклянные иглы необходимы при импрегнации серебром, когда металлические иглами пользоваться нельзя.
Так же необходимо иметь спиртовку, волосяную кисточку для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальную бумагу, иголки, нитки, плотную бумагу для этикетирования материала, лейкопластырь и карандаш по стеклу .
Подготовка предметных стекол.
Предметные стекла, применяемые для получения гистологических препаратов, необходимо предварительно подготовить. Исключение составляют готовые к использованию и специально упакованные импортные предметные стекла.
Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят 15 минут в 2-3 % растворе гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают горячей водой и промывают в течение нескольких часов в проточной воде. Вымытые стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в 96 % спирт. Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из этой смеси, протирают чистой тканью и складывают в коробочку.
Предметные стекла также хорошо обезжириваются в крепком растворе соляной кислоты. Через несколько суток их промывают проточной водой и высушивают.
Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю.
Для лучшей фиксации срезов на стекле его предварительно смазывают смесью белка с глицерином. Свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Применяют также смесь, в состав которой входят 15 мл сыворотки крови, 5 мл дистиллированной воды и 6 мл 5 %-ного формалина. После фильтрации смесь готова к нанесению на предметные стекла. Ее использование дает лучшие результаты, чем применение яичного белка, так как при окрашивании не образуется фон.
Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5-6 стекол в виде веера, а в другую чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне, так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка.
Разработан способ фиксации среза к предметному стеклу без предварительного натирания последнего белком с глицерином.
В ванночку с теплой дистиллированной водой капают несколько капель жидкого казеинового клея и перемешивают. В полученную мутноватую жидкость опускают срезы, расправляют препаровальной иглой и вылавливают на чистое обезжиренное стекло.
Этот способ дает неизменно хороший эффект и вокруг среза отсутствует окрашенный фон, как это часто бывает при применении белка .
Таким образом, для приготовления микропрепаратов требуется специальное оборудование и инструменты. Основными из них являются предметное и покровное стекла. Прежде чем начать готовить микропрепарат, необходимо правильно подготовить предметные стекла. К их хранению также предъявляются специальные требования. Но подготовки одного оборудования не достаточно для приготовления микропрепаратов, необходимо также подготовить материалы для исследования. Подробно об этом говорится в следующем параграфе.
§ 3. Подготовка материала для приготовления микропрепаратов
Микропрепараты делятся на временные и постоянные. Подготовка материала для временных препаратов включает фиксацию и окраску.
Фиксация это процесс быстрой консервации клеточных структур, при котором все физиолого-биохимические процессы останавливаются, а водорастворимые вещества переходят в нерастворимое состояние. Следовательно, фиксация позволяет сохранить внутриклеточные структуры в неизменном виде на длительное время. Однако при фиксации в клетках могут появляться артефакты новые структуры, которые отсутствуют в живой клетке, например, разнообразные вакуоли. Для предотвращения появления артефактов необходимо использовать специально подобранные химические растворы фиксаторы, а сама фиксация должна проводиться в определенных условиях. В частности, желательно использовать охлажденные фиксаторы (до 2-3 градусов); для фиксации нужно брать отдельные клетки или кусочки тканей не толще 5мм; объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 50-100 раз; фиксатор не должен использоваться для длительного хранения материала; фиксатор не должен использоваться повторно.
Рассмотрим состав и применение наиболее широко распространенных фиксаторов.
Формалин (формальдегид, или муравьиный альдегид). Наиболее простой и широко распространенный фиксатор. Применяется в виде водных растворов с концентрацией 4-10 %, при этом за 100 % принимается концентрация продажного формалина. Продажный формалин содержит примесь муравьиной кислоты, которую нейтрализуют с помощью углекислого кальция в течение 24 часов. Время фиксации от 1 часа до 24 часов. Для длительного хранения материал переносят в свежий 10 %-ный формалин. Чистый формалин используют в том случае, если планируется дальнейшее изучение локализации и активности ферментов. Чаще же формалин включается в рецептуру более сложных фиксаторов.
Спиртовые фиксаторы. Содержат этиловый или метиловый спирт. Водные растворы спиртов в чистом виде (70 %, 96 % или 100 %) используются относительно редко. Чаще применяют 100 %-ные спирты, которые смешивают с другими веществами. Нужно иметь в виду, что метиловый спирт (метанол) и его пары ядовиты.
В качестве универсальных фиксаторов используют различные композиции на основе формалина, спиртов, органических кислот и неорганических веществ.
Уксусный алкоголь (ацеталкоголь). Это один из наиболее простых фиксаторов. Состоит из 3 частей абсолютного спирта (этилового, а лучше метилового) и 1 части ледяной уксусной кислоты. Для приготовления 100 %-ного (абсолютного) спирта исходные спирты обезвоживают. Для обезвоживания этилового спирта (этанола) используют безводный сульфат меди, а для обезвоживания метилового спирта (метанола) используют оксид кальция. Хранят их в герметичной посуде. Нужно иметь в виду, что все абсолютные спирты особенно ядовиты. Для приготовления ледяной уксусной кислоты исходную концентрированную кислоту охлаждают в холодильнике; при этом кислота замерзает, раньше, чем вода. Жидкость сливают, а замерзшую кислоту оттаивают и используют для приготовления фиксатора. Фиксатор готов для употребления через 24 часа. Хранить фиксатор в темном холодном месте. Время фиксации 2...24 часа. Затем материал переносят в свежий фиксатор, в котором он может храниться до 1 месяца в холодильнике. Для более длительного хранения материал переносят в 70 %-ный спирт .
Фиксатор Карнуа. Состав абсолютный спирт 10 см 3 ; хлороформ 3 см 3 ; уксусная кислота 1 см 3 . Срок фиксации 1-3 часа .
Фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту, например, смесь Буэна 15 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты: 5 частей формалина: 1 часть ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор готовят непосредственно перед употреблением. Время фиксации от 1 до 24 часов (иногда несколько суток). Фиксированный материал хранят в 70 %-ном спирте.
Фиксаторы, содержащие сулему (хлорид ртути (II) HgCl 2 ). Сулема используется в виде насыщенного водного раствора в смеси с ледяной уксусной кислотой (25:1), формалином (8,5:1) и более сложных композиций (фиксатор «Суза», фиксатор Ценкера и др.). Время фиксации от 1 до 24 часов. Затем сулему удаляют спиртовым раствором йода (6 частей 70 %-ного спирта:1 часть йодной настойки), а йод удаляют 70 %-ным спиртом. Фиксированный материал хранят в 70 %-ном спирте.
Фиксаторы, содержащие осмий (четырехокись осмия, или осмиевая кислота). Дают наилучшие результаты, используются при изготовлении препаратов, как для световой, так и электронной микроскопии. Можно использовать 1-2%-ный раствор осмиевой кислоты, но чаще применяют композиции, например, фиксатор Флеминга 15 частей 2 %-ной осмиевой кислоты: 1 часть ледяной уксусной кислоты. Фиксация протекает медленно (от 24 часов до нескольких суток).
Кроме перечисленных фиксаторов общего назначения, существуют и специальные фиксаторы. Например, фиксатор для митохондрий содержит 4 части 3 %-ного раствора дихромата калия и 1 часть 40 %-ного формалина. Фиксатор для хлоропластов содержит 15 частей насыщенного раствора медного купороса, 1 часть 40 %-ного формалина и 5 частей воды.
В ряде случаев вместо химической фиксации применяется быстрое замораживание образцов, например, при температуре жидкого азота (196 0 ) или при температуре сухого льда (78 0 ). Замороженные объекты могут быть обезвожены путем возгонки воды в вакууме при температуре ниже 40 0 (этот процесс называется лиофилизация).
Окрашивание позволяет выявлять внутриклеточные структуры, обладающие повышенным сродством к определенным красителям. Красители это относительно низкомолекулярные органические вещества, обладающие повышенным сродством к определенным химическим компонентам клетки.
Существует множество красителей, которые используются для различных целей. Нужно иметь в виду, что выбор красителя связан с характером фиксации и различными методами предварительной обработки клеток.
Названия красителей могут соответствовать получаемой окраске (рубин, кармин, метиловый синий, метиленовый синий, генциановый фиолетовый, метиловый зеленый, оранжевый золотой). Иногда русские названия цветов заменяют на немецкие, например: метилблау, генцианвиолет. В других случаях названия носят отвлеченный, исторически сложившийся характер, например: пиронин, фуксин, сафранин, флороглюцин, судан III. Иногда название красителя не соответствует полученной окраске, например, синий тионин дает фиолетово-красное окрашивание. Довольно редко применяются химические номенклатурные названия красителей, например: диметиламинобензальдегид, 8-амино-1-нафтол-5-сульфокислота.
Различают основные (щелочные), кислотные и нейтральные красители. Основные красители избирательно окрашивают базофильные клеточные структуры (то есть структуры с кислотными свойствами). Кислотные красители избирательно окрашивают ацидофильные, или оксифильные клеточные структуры (то есть структуры со щелочными свойствами). Нейтральные красители окрашивают и базофильные, и ацидофильные структуры.
Наименее токсичные красители используются для прижизненной окраски клеток. Эти красители обычно применяют в виде водных растворов, например: метиленовый синий (концентрация от 1:1000 до 1:10000), трипановый синий (0,5 %-ный раствор), нейтральный красный (от 1:50000 до 1:200000).
Красители для фиксированных клеток могут использоваться в чистом виде (водные или спиртовые растворы, концентрация от 0,1 % до 1 %), например: эозин, фуксин. Часто используют смеси красителей, например, смесь РомановскогоГимза (содержит метиленазур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин), окраска по Маллори (последовательное использование кислотного фуксина S, а затем смеси анилинового синего и оранжевого золотого G), азурэозин, метилблауэозин.
Однако чаще краситель образуется в ходе его приготовления. Например, широко известное вещество растительного происхождения гематоксилин становится красителем только после его окисления до гематеина. Для окрашивания ядер и хромосом широко используются красители в сочетании с органическими кислотами. Рассмотрим методики приготовления некоторых наиболее простых красителей.
Приготовление 2 %-ного ацетофуксина. 1 грамм основного фуксина растворяют в 50 мл 40 %-ной уксусной кислоты при подогревании на водяной бане.
Приготовление 1 %-ного ацеторсеина. К 1 грамму орсеина добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и настаивают около 12 часов. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют 50 мл дистиллированной воды. Затем нагревают до кипения и охлаждают, повторяя эту процедуру 10 раз. Через сутки краситель фильтруют. Перед окрашиванием на 9 частей красителя добавляют 1 часть 1 н. HCl.
Приготовление 4 %-ного ацетокармина. Раствор готовят в термостойкой колбе с водяным холодильником. 4 грамма ацетокармина смешивают с 100 мл 50 %-ной уксусной кислоты, и кипятят 1 час. Через сутки краситель фильтруют. Аналогичным образом приготавливается ацетолакмоид.
Вместо уксусной кислоты часто используют другие органические кислоты, например, 40 %-ную молочную кислоту.
Все красители после приготовления фильтруют и хранят в темном прохладном месте. Время окрашивания препаратов зависит от температуры (обычно от 20 минут до 1 суток). При нагревании или кипячении время окрашивания сокращается.
Кроме окрашивания органическими красителями отдельные структуры можно выделить, используя их импрегнацию серебром и другими металлами .
Таким образом, при приготовлении некоторых временных микропрепаратов необходима фиксация и окраска исследуемого материала. Благодаря этому можно лучше рассмотреть объект под микроскопом. Конкретно о способах приготовления микропрепаратов мы расскажем в четвертом параграфе.
§ 4. Способы приготовления микропрепаратов
При изготовлении временных микропрепаратов необходимо соблюдать следующую последовательность операций:
1. Вымыть и тщательно вытереть предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, надо поместить его в складку салфетки между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытереть его круговыми движениями пальцев.
2. Нанести на предметное стекло пипеткой каплю жидкости (воды, глицерина, раствора, реактива или красителя).
3. Сделать срез изучаемого органа при помощи лезвия. Лезвие должно быть очень острым.
4. Выбрать самый тонкий срез, перенести его с помощью препаровальной иглы или тонкой кисточки в центр предметного стекла в каплю жидкости.
5. Закрыть срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло взять двумя пальцами за грани и подвести под углом нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно его опустить.
6. Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу .
Перед учителями биологии и руководителями кружков рано или поздно встает задача изготовить учебный микропрепарат. Какое же вещество, способное надолго зафиксировать биологический объект, и как сделать эту процедуру простой и доступной. Известные бальзамы (смолы-фиксаторы) никогда не относились к легкодоступным веществам, особенно в удалении от крупных городов. Кроме того, говорят, что вещества эти не безвредны. И, наконец, сам процесс их использования довольно непрост.
Для изготовления препарата можно использовать клей ПВА. Важно, чтобы препарат был влажный, хорошо смоченный, а клей свежий и чуть разбавленный чистой холодной кипяченой водой до нужной концентрации (клей представляет собою эмульсию и легко разводится). После нескольких проб и ошибок нужную концентрацию получится составлять и определять без труда.
Затем, на чистое предметное стекло наносят каплю воды кипяченой или дистиллированной. Воду надо аккуратно удалить чистой, не оставляющей волосков тканью или фильтровальной бумагой так, чтобы стекло было чуть влажным. Это, как и влажность образца, способствует равномерному (без пузырьков) смачиванию. На подготовленную поверхность нужно нанести небольшую каплю заранее приготовленного клея ПВА так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Они иногда и не мешают, но внешний вид препарата портят. В эту каплю аккуратно переносят заранее подготовленный срез или образец, например, предварительно умерщвленную горячей водой дафнию. Затем плавным наклонным движением надо сверху положить покровное стекло, также чистое и слегка влажное. Слой клея между стеклами должен быть как можно более тонким.
Если что-то не удалось, а образец ценный и достаточно крупный, почти всегда, в отличие от смол, есть возможность его отмыть простой водой и процедуру повторить. Излишки клея аккуратно смываются тонкой струйкой воды; нужно следить, чтобы она не затекала между стеклами. Покровное стекло необходимо придерживать. Чуть мутноватые остатки воды можно аккуратно удалить фильтровальной бумагой или полоской тонкой ткани без ворса.
Готовые препараты надо разложить в теплом сухом месте. Индикатором готовности препарата служит его прозрачность. В зависимости от очень многих факторов высыхание до прозрачного состояния продолжается от одной до четырех недель. Бывает, что слишком толстый слой клея или клей, загрязненный примесями, полностью прозрачным не становится это несколько ухудшает изображение, но благодаря небольшой глубине резкости микроскопа даже такие препараты доступны для изучения.
Нет гарантии, что этот метод можно применять для изготовления любых препаратов, поскольку некоторые из них требуют окрашивания, а красители могут взаимодействовать с клеем .
Т.Н. Лашкина, учитель биологии и экологии средней школы № 23, из г. Сызрань предлагает следующий способ приготовления микропрепаратов. Можно взять обыкновенный желатин, залить его водой для набухания. Затем в столовую ложку набрать немного набухшего желатина (без воды) и нагреть над огнем. Когда желатин разойдется (не надо, чтобы он закипал), капнуть его на предметное стекло. В эту каплю положить образец и закрыть покровным стеклом, хорошо придавить пальцем его для равномерного распределения желатина. Микропрепарат готов.
Вместо покровного стекла можно использовать целлофан, если нет покровных стекол. Кроме того, целлофан имеет одно преимущество: микропрепарат нельзя раздавить, т.к. целлофан эластичен и не трескается, как покровное стекло.
С желатином надо работать быстро, иначе он застывает. Но если такое случится, то достаточно подержать стекло над огнем и желатин вновь станет жидким. Желатин безвреден, доступен и очень экономичен .
Приготовление срезов растений
Для изготовления срезов объект берут большим и указательным пальцами левой руки и при помощи скальпеля или ножа выравнивают его поверхность. В правую руку берут лезвие или бритву и делают им плавное быстрое движение по объекту к себе и вправо (см. приложение рис. 1, А). Срезы должны быть небольшие и тонкие. Их снимают с лезвия мягкой кисточкой и переносят на предметное стекло в каплю среды (см. приложение рис. 1, Б).
Для изготовления срезов мелких объектов последние помещают в сердцевину бузины (см. приложение рис. 2), предварительно сделав в ней разрез или углубление, и проделывают вышеописанную операцию. Лезвие, используемое для получения срезов должно быть острым (должно легко перерезать волос) .
Микропрепараты по ботанике
Препарат среза эпидермы с нижней стороны листа традесканции виргинской в капле воды.
Для изготовления препарата лист традесканции обвернуть вокруг указательного пальца левой руки так, чтобы нижняя сторона фиолетового цвета была обращена наружу. Правой рукой при помощи препаровальной иглы надорвать эпидерму над средней жилкой в средней части листа и пинцетом снять ее кусочек. При этом невольно захватывается и часть мякоти листа (мезофилла), но обычно можно найти тонкий участок на периферии, состоящий из одного ряда клеток эпидермы. Сорванный кусочек положить на предметное стекло в каплю воды наружной стороной вверх и накрыть покровным стеклом .
Препарат клеток листа элодеи канадской.
В верхней части побега элодеи при помощи пинцета оторвите лист и перенесите в каплю воды на предметное стекло. Лист следует положить нижней стороной к предметному стеклу.
Препарат хромопластов в клетках зрелых плодов.
При помощи препаровальной иглы возьмите маленькие кусочки мякоти зрелых плодов ландыша, рябины и шиповника. Поместите каждый кусочек в каплю воды на предметное стекло и аккуратно разделите клетки. Накройте покровным стеклом.
Препарат крахмальных зерен картофеля.
Разрежьте клубень картофеля. Со свежесрезанной поверхности возьмите скальпелем небольшое количество выступившей жидкости и перенесите в каплю воды на предметное стекло, накройте покровным стеклом.
Препарат каменистых клеток околоплодника груши.
На срезе свежего или фиксированного спиртом околоплодника груши найдите группу каменистых клеток, извлеките их. Поместите на предметное стекло и раздавите кончиком скальпеля.
Нанесите на каменистые клетки каплю 1 %-ного раствора флороглюцина в 50 %-ном этаноле, затем добавьте несколько капель концентрированной соляной кислоты (при работе с концентрированной кислотой следует соблюдать правила техники безопасности).
Одревесневшие оболочки приобретут вишнево-красный или малиновый цвет.
После появления окрашивания удалите реактив фильтровальной бумагой, добавьте каплю глицерина и накройте препарат покровным стеклом .
Препарат устьиц клеток растения.
Приготавливают несколько срезов нижней эпидермы листа и помещают их на 2 часа в 5 %-ный раствор глицерина. Срезы помещают на предметное стекло в том же растворе. Рассматривают препарат.
Затем заменяют глицерин на воду, оттягивая его из-под стекла фильтровальной бумагой. Смотрят, что изменилось.
После этого воду заменяют 20%-ным раствором глицерина или 1М раствором сахарозы. Наблюдают изменения (см. приложение рис. 3) .
Приготовление микропрепаратов по зоологии
Приготовление препарата простейших организмов сенного настоя.
С помощью стеклянной палочки поместите на предметное стекло каплю раствора метилцеллюлозы.
Пипеткой капните в этот раствор сенный настой. Накройте каплю покровным стеклом. Рассмотрите под микроскопом [ 6 ] .
Приготовление микропрепаратов по физиологии человека
Препарат мазка крови для исследования лейкоцитарной формулы. Каплю крови наносят на сухое предметное стекло (см. приложение рис. 4, а). Шлифовальное стекло устанавливают под углом 45° к предметному. Кровь при соприкосновении со шлифовальным стеклом растекается по его краю (см. приложение рис. 4, б). После этого быстрым движением шлифовальное стекло продвигают вперед, скользя по поверхности предметного стекла. При этом кровь тонким равномерным слоем размазывается по предметному стеклу (см. приложение рис. 4, в).
Хорошо приготовленный мазок крови выглядит на просвет желтоватым, равномерным и прозрачным. В этом случае форменные элементы крови располагаются в нем в один слой .
Приготовление микропрепаратов по микробиологи
Приготовление препаратов мертвых клеток микроорганизмов.
Для детального изучения микроорганизмов применяют фиксированные микропрепараты. При фиксации микробов убивают и затем окрашивают.
Приготовление фиксированных препаратов складывается из следующих операций: приготовление мазка, высушивание препарата, его фиксация, окраска и просушивание.
1 этап: Техника приготовления мазков (см. приложение рис. 5).
- Приготовление мазка с плотной питательной среды
- на обезжиренное предметное стекло наносят петлей небольшую каплю физиологического раствора;
- в правую руку берут бактериологическую петлю, в левую пробирку с культурой;
- петлю стерилизуют, внося ее в пламя горелки в вертикальном положении (накаливание докрасна) (см. приложение рис. 5-1);
- вынимают пробку из пробирки, захватив ее мизинцем правой руки, и обжигают на спиртовке край пробирки (см. приложение рис. 5-2,3);
- петлю вносят в пробирку, охлаждают ее, прикасаясь к стенкам, после чего с поверхности среды снимают небольшое количество культуры (см. приложение рис. 5-4);
- петлю вынимают, не касаясь стенок пробирки, обжигают края пробирки над спиртовкой и закрывают пробкой (см. приложение рис. 5-5,6);
- захваченную микробную культуру вносят в каплю физиологического раствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде овала, круга или квадрата площадью 1-1,5см 2 (см. приложение рис. 5-7);
- по окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют (см. приложение рис. 5-8).
- При изготовлении мазка из культур с жидких питательных сред на предметное стекло наносят 1-3 петли исследуемого материала и равномерно распределяют по нему; при этом использование физиологического раствора не требуется. Далее поступают как описано выше.
2 этап: Высушивание мазков.
Приготовленный мазок высушивают на воздухе, над пламенем горелки (но не в пламени), в потоке теплого воздуха или в термостате.
Необходимо знать, что нагревание может нарушить структуру микробов, а так же то, что не до конца высушенный препарат при фиксации окажется испорченным.
3 этап: Фиксация мазков.
Различают физический и химический методы. При фиксации физическим методом стекло с мазком, обращенным кверху, медленно проводят 3-4 раза через пламя. При этом микроорганизмы погибают, мазок прикрепляется к стеклу и не смывается. С недофиксированного мазка микробы смываются, в перефиксированном наблюдается деструкция микроорганизмов, то есть распад на отдельные фрагменты.
Фиксация химическим методом достигается погружением мазков в фиксирующую жидкость, которой может служить:
Спирт (15-20 мин)
Спирт-эфир (10-15 мин)
Метиловый спирт (5 мин)
Хлороформ (несколько секунд)
Охлажденный ацетон (5 мин)
4 этап: Окраска мазков.
Окраска микроорганизмов имеет большое диагностическое значение. Она представляет собой сложный физико-химический процесс, в механизме которого существенную роль играют явления адсорбции, капиллярности, химического сродства между красителями и окрашиваемым объектом, рН среды, в которой они находятся.
Различают простые (ориентировочные) и сложные (дифференциальные) методы окраски микроорганизмов.
Простая окраска.
Простая окраска бактерий выявляет только их морфологию (форму, размер и взаимное расположение микробов). Обычно употребляется только один краситель (метиленовый синий или генциановый фиолетовый). Выделяют позитивный и негативный методы окрашивания.
Позитивный:
- Приготовленный и фиксированный мазок помещают в специальный мостик над ванночкой.
- Наносят какой-либо краситель на определенное время (количество краски должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка, достаточно нескольких капель). При этом необходимо следить, чтобы краситель на мазке не подсыхал, в случае необходимости на мазок наливают новые порции красителя.
- Затем тщательно и быстро промывают водой.
- Высушивают фильтровальной бумагой.
- Наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют.
Мазок считается качественным, если бактерии расположены изолированно друг от друга и равномерно окрашены.
Негативный:
При этом методе окрашивается фон мазка, а микроорганизмы остаются неокрашенными. Он применяется для исследования микроорганизмов, оболочки которых плохо воспринимают анилиновые красители (лептоспиры, спирохеты).
- На край предметного стекла наносят каплю туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.
- Мазок делают ребром шлифованного предметного стекла аналогично приготовлению мазка крови (см. приложение рис. 6). Предметное стекло кладут на горизонтальную поверхность и придерживают левой рукой; правой рукой к капле придвигают под углом в 45 0 шлифовальное стекло, по краю которого равномерно растекается капля; сразу же, плотно прижимая шлифовальное стекло в том же положении под углом, продвигают его налево по предметному стеклу, получая равномерный мазок.
- Дают высохнуть и микроскопируют.
Дифференциальная (сложная) окраска.
Сложные, или дифференциальные способы окраски бактерий основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Позволяют, применяя несколько растворов красителей и реактивов, определить морфологические свойства и структурные компоненты клетки (споры, капсулы, жгутики и др.).
Одним из важнейших методов является окрашивание микробов по Граму. Это универсальный дифференциально-диагностический метод окраски, предложенный датским ученым Грамом в 1884г. Он используется в качестве одного из ключей в определителях микробов.
Окрашивание микробов по Граму.
Грампринадлежность микробов зависит от химического состава бактериальной клетки и строения клеточной стенки.
- На фиксированный мазок кладут небольшой кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты.
- Снимают бумагу, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту (мазок чернеет).
- Обработка мазка спиртом в течение 30 секунд (погружают в стаканчик 2-3 раза).
- Промывают водой.
- Дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1-2 минут.
- Сливают краску, промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой, исследуют с иммерсионной системой.
Грамположительные микроорганизмы окрашиваются фиолетовым цветом, не обесцвечиваются спиртом и не воспринимают основной фуксин. Грамотрицательные микроорганизмы обесцвечиваются спиртом и приобретают розово-красный цвет от окрашивания фуксином.
Обнаружение капсул методом негативного контрастирования.
Небольшое количество клеток с твердой питательной среды помещают петлей на предметное стекло в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. На сером фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки микроорганизмов окрашены в розовый цвет.
Окраска эндоспор.
- На фиксированный мазок наливают метиленовый синий (по Леффлеру).
- Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло пинцетом над пламенем горелки. По мере испарения красителя его добавляют. Продолжительность окраски трехкратная, по 10-15 секунд.
- Предметное стекло охлаждают и тщательно промывают водой.
- Дополнительно в течение 30 секунд докрашивают 0,5%-ным водным раствором сафранина (или фуксина Циля).
- Краситель сливают, препарат промывают водой, сушат и рассматривают под микроскопом.
При правильном окрашивании вегетативные клетки имеют красный, а споры синий цвет (светло-розовый).
5 этап: Просушивание.
Оставшуюся на стекле после промывания воду осторожно удаляют фильтровальной бумагой, или отсасывая ее краем бумаги, или слегка прижимая кусочек бумаги к мазку. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим, так как остаток воды образует с кедровым маслом, нанесенным на мазок, мутную эмульсию, что мешает микроскопированию.
Приготовление препаратов живых клеток микроорганизмов.
Метод изучения микробов в живом неокрашенном состоянии имеет следующие преимущества:
- Микробы изучаются в неповрежденном виде.
- Наблюдение микробов в живом виде позволяет выявить ряд свойств, не обнаруживаемых у убитых микробов (активная подвижность).
Вместе с тем метод имеет и ряд недостатков:
- Трудность исследования неокрашенных микробов ввиду их малой величины.
- Невозможность длительно сосредоточит внимание на микробе, так как он быстро перемещается из поля зрения.
В живом состоянии микробов исследуют в “раздавленной капле”, “висячей капле” и “отпечатком”, также рассматривают “агаровую пленку”; в некоторых случаях при этом применяют прижизненную (витальную) окраску микробов .
Препарат “раздавленная капля”.
На предметное стекло наносят каплю воды, помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные и на плоской и в жидкой питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей; выращенные в жидкой среде можно переносить так же стерильной пипеткой. При продолжительном изучении микроскопируемого объекта края покровного стекла рекомендуется залить лаком для ногтей, что предотвратит быстрое высыхание препарата (см. приложение рис. 7).
Препарат “висячая капля”.
Каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде. При работе с бактериями используется редко (см. приложение рис. 8).
Препарат “отпечаток”.
Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тот час же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Используют в основном при исследовании спороношения стрептомицетов.
Препарат “агаровая пленка” (или “микрокультура”).
На тонкое простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0,2-0,3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют по всей поверхности стекла. После застывания среды удаляют петлей лишний агар, оставляя два тонких участка пленки, величиной с покровное стекло каждый. В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма. Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Перед микрокопированием на пленку с выросшей микрокультурой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыхания пленки и затем осторожно накрывают покровным стеклом .
Прижизненная окраска микробов.
При работе с раздавленной каплей для лучшей видимости микробов жидкость можно слегка подкрасить, вводя под покровное стекло небольшую каплю красителя. При этом бактерии окрасятся и будут отчетливее видны в поле зрения микроскопа.
1 способ окраски:
- На чистое предметное стекло наносят насыщенный водный раствор метиленовой сини.
- Дают высохнуть.
- Фильтровальной бумагой протирают стекло, пока налет не примет светло-голубого оттенка.
- На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и накрывают покровным стеклом.
- Микробы постепенно окрашиваются в голубой цвет, оставаясь живыми.
2 способ окраски:
Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с краской (0,1-0,01%), накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом .
Таким образом, мы изучили, какие существуют способы приготовления как временных, так и постоянных микропрепаратов, из каких организмов их можно приготовить. Выяснили, что микропрепараты широко используются во всех биологических науках.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение научной и методической литературы позволило нам сделать выводы о том, что микропрепараты широко используются на уроках биологии и для этого необходимо уметь их изготовлять.
Микропрепараты делят на временные и постоянные. Временные препараты не хранятся, их готовят в ходе лабораторной работы, непосредственно перед изучением объекта. Постоянные препараты могут храниться много лет. В основном их изготавливают промышленным путем, но можно их приготовить и самостоятельно.
К микропрепаратам предъявляют определенные требования по изготовлению, хранению и использованию, которые необходимо соблюдать.
Перед занятием учитель должен проинструктировать учащихся как правильно обращаться с микропрепаратами.
Для приготовления микропрепаратов по биологии необходимы специальное оборудование и инструменты: предметные стекла, покровные стекла, пипетки, чашки Петри, различные колбы, препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, спиртовки и др. К оборудованию, используемому при приготовлении микропрепаратов, так же как и к самим микропрепаратам предъявляются требования по хранению и подготовке, которые тоже нужно соблюдать.
Иногда, материал для микропрепаратов нужно зафиксировать и окрасить, для чего используются специальные красители и фиксаторы.
Микропрепараты можно приготовить различными способами. Это и приготовление срезов, мазков, отпечатков, и приготовление микропрепаратов живых клеток организмов (висячая капля, раздавленная капля, отпечаток, агаровая пленка) все это временные микропрепараты. Материалом для них могут быть различные части растений, ткани, микроорганизмы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
- Бавтуто Г.А. Практикум по анатомии и морфологии растений [Текст] / Г.А. Бавтуто, Л.М. Ерей. М. : Новое издание, 2002. 464с. : ил.
- Микробиология [Текст] : методические рекомендации к проведению лабораторных занятий для студентов-биологов / сост. Н. В. Шарыпова.- испр., допол.- Шадринск, 2009. - 47 с., ил.
- Практикум по анатомии и морфологии растений [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / В.П. Викторов, М.А. Гуленкова, Л.Н. Дорохина и др.; Под ред. Л.Н. Дорохиной. - М. : Академия, 2001. 176 с.
- Практикум по микробиологии [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. М. : Академия, 2005. 608 с.
- Практикум по физиологии растений [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. пед. учеб. заведений / И.В. Плотникова, Е.А. Живухина, О.Б. Михалевская и др.; Под ред. В.Б. Иванова. М. : Академия, 2001. 144 с.
- Суханова Л.В. Тетрадь для лабораторных работ (7-8 класс) [Текст] / Л.В. Суханова // 1 сентября: изд. дом 1 сентября. 2004. № 25-26. С. 36-46.
- Баринов О.Г. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://bio.1september.ru/articlef.php?ID=200104304 . - Заглавие с экрана.
- Википедия [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/Микропрепарат - заглавие с экрана.
- Методические рекомендации [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://freecode.pspo.perm.ru/080/work/МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНД АЦИИ. htm - заглавие с экрана.
- http://labx.narod.ru/documents/micropreparaty.html - заглавие с экрана.
- Микроскопическая техника в биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://labx.narod.ru/documents/microscope_slides.html - заглавие с экрана.
- Микроскопическая техника в биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://labx.narod.ru/documents/prigotovlenie_micropreparatov.html - заглавие с экрана.
- Сайт учителя биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://tana.ucoz.ru/load/436-1-0-354 - заглавие с экрана.
- Уголок России. Природа Кузбасса [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://prirodakem.narod.ru/Biblioteka/My_st/doci/kl_ob.htm - заглавие с экрана.
- Фирма "Новый лицей" [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://novylicey.narod.ru/microprep_3_5.htm - заглавие с экрана.
- Электронная библиотека ГАГУ(Горно-Алтайский государственный университет) [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://elib.gasu.ru/eposobia/papina/malprak1/R_1_2.html - заглавие с экрана.
Приложение
Рис. 1. Положение рук при изготовлении среза (А) и снятие срезов с бритвы (Б)
Рис. 2. Закладка объекта в сердцевину бузины.
Рис. 3. Приготовление микропрепарата.
Накрывание объекта покровным стеклом.
Рис. 4. Схема приготовления мазка крови
Рис. 5. Приготовление препарата-мазка
Рис. 6. Приготовление мазка.
Рис. 7. “Раздавленная капля”: вид сверху и сбоку
Рис. 8. “Висячая капля”: вид сверху и сбоку
Для приготовления временных микропрепаратов необходимо иметь набор предметных и покровных стекол, препаровальные иглы, бритвы, скальпели, стеклянные палочки для воды, пинцеты, фильтровальную бумагу, некоторые реактивы.
Предметное и покровное стекла промывают водой и протирают досуха мягкой тряпочкой. Тонкий срез растительного объекта помещают в каплю воды на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Если жидкость на препарате выступает за края покровного стекла, то излишек ее удаляют полосками фильтровальной бумаги. Если вода не покрывает всю площадь под покровным стеклом, пипеткой наносят близ края покровного стекла еще каплю, которая сама втягивается под стекло.
При необходимости введения какого-либо красящего реактива воду из-под покровного стекла отсасывают с помощью фильтровальной бумаги, а капельку реактива наносят с противоположной стороны в край покровного стекла.
Красящими реактивами могут быть следующие вещества:
1) йод, растворенный в йодиде калия (для окрашивания зерен крахмала в клетках);
2) хлор-цинк-йод (для окрашивания целлюлозных клеточных оболочек);
3) флороглюцин и соляная кислота (для окрашивания одревесневших оболочек);
4) фуксин (для окрашивания цитоплазмы);
5) гематоксилин (для окрашивания ядер);
6) глицерин (для просветления препарата).
Клетка – основная структурная и функциональная единица тела растения. У одноклеточных растений клетка функционирует как целый организм, у многоклеточных организмов наблюдается дифференциация клеток. Поэтому размеры, форма и строение клеток у таких организмов весьма разнообразны. Взрослая живая растительная клетка состоит из протопласта, окруженного клеточной оболочкой и содержащего неживые включения (запасные вещества и конечные продукты метаболизма).
Протопласт – живое содержимое клетки – состоит из органоидов, или органелл, окруженных гиалоплазмой. Органеллы можно разделить на три группы: двумембранные – ядро, пластиды, митохондрии; одномембранные – эндоплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть – ЭПС), аппарат (комплекс) Гольджи, вакуоль, лизосомы, плазмалемма; немембранные – рибосомы, микротрубочки, микрофиламенты. Гиалоплазма представляет собой непрерывную коллоидную фазу клетки, обладающую определенной вязкостью. Она окружает все органеллы и обеспечивает их взаимодействие. Гиалоплазму с органеллами, за вычетом ядра и пластид, называют цитоплазмой .
Ядро – обязательная часть эукариотической клетки. Это место хранения и воспроизведения наследственной информации. Ядро также служит центром управления обменом веществ и почти всех процессов, происходящих в клетке. Снаружи ядро покрыто двойной мембраной – ядерной оболочкой, пронизанной порами, на краях которых наружная мембрана переходит во внутреннюю. Внутреннее содержимое ядра – кариоплазма с погруженными в нее хроматином и ядрышками, и рибосомами.
Митохондрии – присутствуют во всех живых эукариотических клетках. Их внутренняя мембрана образует выросты в полость митохондрии в виде пластин или трубок, называемые кристами. Пространство между кристами заполнено однородным матриксом. В матриксе встречаются рибосомы и собственная ДНК. Основная функция митохондрий – обеспечение энергетических потребностей клетки путем дыхания.
Пластиды – органеллы, встречающиеся только в растительной клетке. Они представлены хлоропластами (зеленые), хромопластами (желтые, оранжевые, красно-оранжевые) и лейкопластами (бесцветные). Хлоропласты имеют двумемранную оболочку. Внутренняя мембрана вдается в полость хлоропласта немногочисленными выростами. Между выростами находится строма. Выросты и строма формируют в полости хлоропласта сложную систему мембранных поверхностей, отграничивающих особые плоские мешки, называемые тилакоидами или ламеллами. Тиллакоиды образуют стопки – граны . В мембранах тилакоидов сосредоточен главнейший пигмент зеленых растений – хлорофилл и вспомогательные пигменты – каротиноиды.
Эндоплазматическая сеть – трехмерная система вакуолей и канальцев, имеющая форму плоских мешочков или цистерн. Шероховатая ЭПС является местом синтеза белка и покрыта многочисленными рибосомами. Гладкая ЭПС лишена рибосом и служит местом образования липидов.
Вакуоли
– полости в протопласте эукариотических клеток. Вакуоли – это производные ЭПС, ограниченные мембраной – тонопластом
и заполненные водянистым содержимым – клеточным соком. В молодых растительных клетках вакуоли представляют сиситему канальцев и пузырьков (провакуоли), по мере роста клеток они увеличиваются и сливаются в одну большую вакуоль. Она занимает 70-90% объема клетки, а протопласт располагается в виде тонкого постенного слоя. В основном увеличение размеров клетки
происходит за счет роста вакуоли. В результате возникает тургорное давление и поддерживается упругость клеток и тканей.
Клеточный сок представляет собой водный раствор минеральных солей и различных органических соединений: углеводов (моно-, ди- и полисахариды), белков, органических кислот и их солей (наиболее часто встречаются лимонная, яблочная, янтарная, щавелевая кислоты и их производные), алкалоидов (азотсодержащие соединения, многие из которых – растительные яды, некоторые используются человеком – кофеин, атропин, хинин, морфин, кодеин), танинов (фенольные производные), гликозидов (производные cахаров). Среди последних наиболее интересна группа флавоноидов (это пигменты двух основных цветов: флавоны – желтые и антоцианы – красно-фиолетовые). Наиболее часто флавоноиды содержатся в клетках околоцветника цветков, которым они придают разнообразную окраску. Интересно, что антоцианы способны изменять цвет в зависимости от реакции клеточного сока: при слабокислой – красные, а при нейтральной или основной – сине-фиолетовые. Изменение окраски антоцианов можно наблюдать при раскрывании цветков незабудки, медуницы или окопника шероховатого. У бутонов этих растений венчики розовые, а у раскрывшихся цветков – синие или фиолетовые. Помимо лепестков антоцианы могут содержаться в других частях растения – листьях, стеблях, корнях, придавая им характерный цвет.
Аппарат Гольджи состоит из отдельных диктиосом и пузырьков Гольджи. Диктиосомы – стопки плоских, не соприкасающихся друг с другом дисковидных цистерн, ограниченных мембранами. Пузырьки Гольджи отчленяются от краев диктиосомных пластинок или концов трубок и направляются в сторону плазмалеммы или вакуоли. Пузырьки Гольджи транспортируют образовавшиеся полисахариды.
Лабораторная работа № 1Тема: «Приготовление и описание микропрепаратов клеток различных организмов».
Цель работы: закрепить умение готовить микропрепараты и рассматривать их под микроскопом, находить особенности строения клеток различных организмов, владеть терминологией темы.
Оборудование: кожица чешуи луковицы, эпителиальные клетки из полости рта человека, культура сенной палочки, стакан с водой, микроскоп, чайная ложечка, покровное и предметное стекла, синие чернила, йод, микропрепараты клеток многоклеточного животного организма, тетрадь, ручка, простой карандаш, линейка,
Ход работы:
Работа 1.
1. Рассмотрите на рисунке последовательность приготовления препарата кожицы чешуи лука.
2. Подготовьте предметное стекло, тщательно протерев его марлей.
3. Пипеткой нанесите 1-2 капли воды на предметное стекло.
4. При помощи препаровальной иглы осторожно снимите маленький кусочек прозрачной кожицы с внутренней поверхности чешуи лука. Положите кусочек кожицы в каплю воды и расправьте кончиком иглы.
5. Накройте кожицу покровным стеклом, как показано на рисунке.
6. Рассмотрите приготовленный препарат при малом увеличении. Отметьте, какие части клетки вы видите.
7. Окрасьте препарат раствором йода. Для этого нанесите на предметное стекло каплю раствора йода. Фильтровальной бумагой с другой стороны оттяните лишний раствор.
8. Рассмотрите окрашенный препарат. Какие изменения произошли
?
9. Рассмотрите препарат при большом увеличении. Найдите на нем хлоропласты в клетках листа, темную полосу, окружающую клетку, оболочку; под ней золотистое вещество - цитоплазму (она может занимать всю клетку или находиться около стенок). В цитоплазме хорошо видно ядро. Найдите вакуоль с клеточным соком (она отличается от цитоплазмы по цвету).
10. Зарисуйте 2-3 клетки кожицы лука. Обозначьте оболочку, цитоплазму, ядро, вакуоль с клеточным соком.
В цитоплазме растительной клетки находятся многочисленные мелкие тельца - пластиды. При большом увеличении они хорошо видны. В клетках разных органов число пластид различно.
У растений пластиды могут быть разных цветов: зеленые, желтые или оранжевые и бесцветные. В клетках кожицы чешуи лука, например, пластиды бесцветные.
Работа 2.
1. Приготовьте микропрепарат бактерии сенной палочки.
2. Рассмотрите препараты под микроскопом.
3. Рассмотрите готовые микропрепараты клеток многоклеточного животного организма.
4.Сопоставьте увиденное с изображением объекта на рисунке.
Работа 3
Рассмотрите готовые микропрепараты клеток многоклеточных животных
Сопоставьте увиденное с изображением объекта на рисунке.
3. Обозначьте органоиды клетки, изображенные на рис. 4
Лабораторная работа № 2
Тема: “Наблюдение явления плазмолиза и деплазмолиза”
Цель: убедиться в существовании явления плазмолиза и деплазмолиза в живых клетках растений и скорости прохождения физиологических процессов.
Оборудование: микроскопы, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, стаканы с водой, фильтровальная бумага, раствор поваренной соли, репчатый лук.
Ход работы
Снимите нижнюю кожицу чешуи лука (4мм 2);
Приготовьте микропрепарат, рассмотрите и зарисуйте 4-5 клеток увиденного;
С одной стороны покровного стекла нанесите несколько капель раствора поваренной соли, а с другой стороны полоской фильтровальной бумаги оттяните воду;
Рассмотрите микропрепарат в течение нескольких секунд. Обратите внимание на изменения, произошедшие с мембранами клеток и время за которое эти изменения произошли. Зарисуйте изменившийся объект.
Нанесите несколько капель дистиллированной воды у края покровного стекла и оттяните ее с другой стороны фильтровальной бумагой, смывая плазмолизирующий раствор.
В течение нескольких минут рассматривайте микропрепарат под микроскопом. Отметьте изменения положения мембран клеток и время, за которое эти изменения произошли.
Сопоставьте увиденное с изображением объекта на рисунке 1.
Зарисуйте изучаемый объект.
Сделайте вывод в соответствии с целью работы, отметив скорость плазмолиза и деплазмолиза. Объясните разницу в скорости этих двух процессов.
1. Куда двигалась вода (в клетки или из них) при помещении ткани в раствор соли?
2.Чем можно объяснить такое направление движения воды?
3. Куда двигалась вода при помещении ткани в воду? Чем это объясняется?
4. Как вы думаете, что бы могло произойти в клетках, если бы их оставили в растворе соли на длительное время?
5. Можно ли использовать раствор соли для уничтожения сорняков?
6. Дайте определение терминам – плазмолиз, деплазмолиз, осмос, тургор.
7. Объясните, почему в варенье яблоки становятся менее сочными?
Рис 1. Плазмолиз и деплазмолиз
Лабораторная работа № 3
Тема: «Сравнение строения клеток растений и животных, грибов, бактерий».
Цель: научитьсянаходить особенности строения клеток различных организмов, сравнивать их между собой; владеть терминологией темы.
Оборудование: микроскопы, предметные и покровные стекла, стаканы с водой, стеклянные палочки, лист растения элодеи, дрожжи, культура сенной палочки, микропрепараты клеток многоклеточных животных.
Работа 1.
1.Приготовьте препарат клеток листа элодеи. Для этого отделите лист от стебля, положите его в каплю воды на предметное стекло и накройте покровным стеклом.
2. Рассмотрите препарат под микроскопом. Найдите в клетках хлоропласты.
3. Зарисуйте строение клетки листа элодеи. Сделайте надписи к своему рисунку.
4.Рассмотрите рисунок 1. Сделайте вывод о форме, размерах клеток разных органов растений
Рис. 1. Окраска, форма и размеры клеток разных органов растений
Работа 2.
1.Снимите чайной ложечкой немного слизи с внутренней стороны щеки. 2. Поместите слизь на предметное стекло и подкрасьте разбавленными в воде синими чернилами. Накройте препарат покровным стеклом. 3. Рассмотрите препарат под микроскопом.
Работа 3
Рассмотрите готовый микропрепарат клеток многоклеточного животного организма.
Сравните между собой эти клетки.
Результаты сравнения занесите в таблицу 1
Ответьте на вопросы:
В чем заключается сходство и различие клеток?
Каковы причины сходства и различия клеток разных организмов?
Практическая работа
Тема: «Составление простейших схем скрещивания».
Цель: научиться выписывать типы гамет, образуемые организмами с заданными генотипами; кратко записывать условие генетических задач; решать ситуационные задачи по генетике; использовать навыки генетической терминологии.
Оборудование: учебник, тетрадь, условия задач, ручка.
Ход работы:
Задание 1
Выпишите все типы гамет, образуемые организмами, имеющие следующие генотипы: ААbb, Aa, MmPP, PPKk, AabbCc, AabbCcPP, AaBbCc.
Выписывая гаметы, необходимо помнить, что у организма, гомозиготного по одному (АА) или нескольким (ААbbcc) генам, все гаметы одинаковы по этим генам, так как несут один и тот же аллель.
В случае гетерозиготности по одному гену (Аа) организм образует два типа гамет, несущие разные его аллели. Дигетерозиготный организм (АаВb) образует четыре типа гамет. В целом организм образует тем больше типов гамет, чем по большему числу генов он гетерозиготен. Общее число типов гамет равно 2 в степени n, где n- число генов в гетерозиготном состоянии. Выписывая гаметы, необходимо руководствоваться законом «чистоты» гамет, в соответствии с которым каждая гамета несет по одному из каждой пары аллельных генов.
Задание 2
Научитесь кратко записывать условие генетической ситуационной задачи и ее решение.
При краткой записи условия генетической задачи доминантный признак обозначают прописной (А), а рецессивный – строчной (а) буквой с обозначением соответствующего варианта признака. Генотип организма, имеющего доминантный признак, без дополнительных указаний на его гомо- или гетерозиготность в условии задачи, обозначается А?, где вопрос отражает необходимость установления генотипа в ходе решения задачи. Генотип организма с рецессивными признаками всегда гомозиготен по рецессивному аллелю – аа. Признаки, сцепленные с полом обозначаются в случае Х – сцепленного наследования как Хª или ХА
Пример краткой записи условия и решения задачи
Задача. У человека вариант карего цвета глаз доминирует над вариантом голубого цвета. Голубоглазая женщина выходит замуж за гетерозиготного кареглазого мужчину. Какой цвет глаз может быть у детей?
Краткая запись условия Краткая запись решения
А - карий цвет глаз Родители- Р аа х Аа
А – голубой цвет глаз гаметы - G а А, а
Родители: аа х Аа потомство - F Аа аа
Потомство? карий цвет голубой цвет
Задание 3
Кратко запиши условие генетической ситуационной задачи и ее решение.
Задача: Учеловека близорукость доминирует над нормальным зрением. У близоруких родителей родился ребенок с нормальным зрением. Каков генотип родителей? Какие еще дети могут быть от этого брака?
Практическая работа
Тема: «Решение генетических задач».
Цель: научиться решать генетические задачи; объяснять влияние внешних факторов на проявление признака; использовать навыки генетической терминологии.
Оборудование: учебник, тетрадь, условия задач, ручка.
Ход работы:
1. Вспомнить основные законы наследования признаков.
2. Коллективный разбор задач на моногибридное и дигибридное скрещивание.
3. Самостоятельное решение задач на моногибридное и дигибридное скрещивание, подробно описывая ход решения и сформулировать полный ответ.
4. Коллективное обсуждение решения задач между учащимися и учителем.
5. Сделать вывод.
Задачи на моногибридное скрещивание
Задача № 1. У крупного рогатого скота ген, обусловливающий черную окраску шерсти, доминирует над геном, определяющим красную окраску. Какое потомство можно ожидать от скрещивания гомозиготного черного быка и красной коровы?
Разберем решение этой задачи. Вначале введем обозначения. В генетике для генов приняты буквенные символы: доминантные гены обозначают прописными буквами, рецессивные - строчными. Ген черной окраски доминирует, поэтому его обозначим А. Ген красной окраски шерсти рецессивен - а. Следовательно, генотип черного гомозиготного быка будет АА. Каков же генотип у красной коровы? Она обладает рецессивным признаком, который может проявиться фенотипически только в гомозиготном состоянии (организме). Таким образом, ее генотип аа. Если бы в генотипе коровы был хотя бы один доминантный ген А, то окраска шерсти у нее не была бы красной. Теперь, когда генотипы родительских особей определены, необходимо составить схему теоретического скрещивания
Черный бык образует один тип гамет по исследуемому гену - все половые клетки будут содержать только ген А. Для удобства подсчета выписываем только типы гамет, а не все половые клетки данного животного. У гомозиготной коровы также один тип гамет - а. При слиянии таких гамет между собой образуется один, единственно возможный генотип - Аа, т.е. все потомство будет единообразно и будет нести признак родителя, имеющего доминантный фенотип - черного быка..
Таким образом, можно записать следующий ответ: при скрещивании гомозиготного черного быка и красной коровы в потомстве следует ожидать только черных гетерозиготных телят
Следующие задачи следует решить самостоятельно, подробно описав ход решения и сформулировав полный ответ.
Задача № 2. Какое потомство можно ожидать от скрещивания коровы и быка, гетерозиготных по окраске шерсти?
Задача № 3. У морских свинок вихрастая шерсть определяется доминантным геном, а гладкая - рецессивным.
1. Скрещивание двух вихрастых свинок между собой дало 39 особей с вихрастой шерстью и 11 гладкошерстных животных. Сколько среди особей, имеющих доминантный фенотип, должно оказаться гомозиготных по этому признаку?
2. Морская свинка с вихрастой шерстью при скрещивании с особью, обладающей гладкой шерстью, дала в потомстве 28 вихрастых и 26 гладкошерстных потомков. Определите генотипы родителей и потомков.
Задачи на ди- и полигибридное скрещивание
Задача № 7. Выпишите гаметы организмов со следующими генотипами: ААВВ; aabb; ААЬЬ; ааВВ; АаВВ; Aabb; АаВЬ; ААВВСС; ААЬЬСС; АаВЬСС; АаВЬСс.
Разберем один из примеров. При решении подобных задач необходимо руководствоваться законом чистоты гамет: гамета генетически чиста, так как в нее попадает только один ген из каждой аллельной пары. Возьмем, к примеру, особь с генотипом АаВbСс. Из первой пары генов - пары А - в каждую половую клетку попадает в процессе мейоза либо ген А, либо ген а. В ту же гамету из пары генов В, расположенных в другой хромосоме, поступает ген В или b. Третья пара также в каждую половую клетку поставляет доминантный ген С или его рецессивный аллель - с. Таким образом, гамета может содержать или все доминантные гены - ABC, или же рецессивные - abc, а также их сочетания: АВс, AbC, Abe, аВС, аВс, а bС.
Чтобы не ошибиться в количестве сортов гамет, образуемых организмом с исследуемым генотипом, можно воспользоваться формулой N = 2n, где N - число типов гамет, а n - количество гетерозиготных пар генов. В правильности этой формулы легко убедиться на примерах: гетерозиготаАа имеет одну гетерозиготную пару; следовательно, N = 21 = 2. Она образует два сорта гамет: А и а. ДигетерозиготаАаВЬ содержит две гетерозиготные пары: N = 22 = 4, формируются четыре типа гамет: АВ, Ab, aB, ab. ТригетерозиготаАаВЬСс в соответствии с этим должна образовывать 8 сортов половых клеток N = 23 = 8), они уже выписаны выше.
Задача № 8. У крупного рогатого скота ген комолости доминирует над геном рогатости, а ген черного цвета шерсти - над геном красной окраски. Обе пары генов находятся в разных парах хромосом.
1. Какими окажутся телята, если скрестить гетерозиготных по обеим парам
Признаков быка и корову?
2. Какое потомство следует ожидать от скрещивания черного комолого быка, гетерозиготного по обеим парам признаков, с красной рогатой коровой?
Дополнительные задачи к лабораторной работе
Задача № 1. На звероферме получен приплод в 225 норок. Из них 167 животных имеют коричневый мех и 58 норок голубовато-серой окраски. Определите генотипы исходных форм, если известно, что ген коричневой окраски доминирует над геном, определяющим голубовато-серый цвет шерсти.
Задача № 2. У человека ген карих глаз доминирует над геном, обусловливающим голубые глаза. Голубоглазый мужчина, один из родителей которого имел карие глаза, женился на кареглазой женщине, у которой отец имел карие глаза, а мать - голубые. Какое потомство можно ожидать от этого брака?
Задача № 3. Альбинизм наследуется у человека как рецессивный признак. В семье, где один из супругов альбинос, а другой имеет пигментированные волосы, есть двое детей. Один ребенок альбинос, другой - с окрашенными волосами. Какова вероятность рождения следующего ребенка-альбиноса?
Задача № 4. У собак черный цвет шерсти доминирует над кофейным, а короткая шерсть - над длинной. Обе пары генов находятся в разных хромосомах.
1. Какой процент черных короткошерстных щенков можно ожидать от скрещивания двух особей, гетерозиготных по обоим признакам?
2. Охотник купил черную собаку с короткой шерстью и хочет быть уверен, что она не несет генов длинной шерсти кофейного цвета. Какого партнера по фенотипу и генотипу надо подобрать для скрещивания, чтобы проверить генотип купленной собаки?
Задача № 5. У человека ген карих глаз доминирует над геном, определяющим развитие голубой окраски глаз, а ген, обусловливающий умение лучше владеть правой рукой, преобладает над геном, определяющим развитие леворукости. Обе пары генов расположены в разных хромосомах. Какими могут быть дети, если родители их гетерозиготны?
Задача №6. У человека рецессивный ген а детерминирует врождённую глухонемоту. Наследственно глухонемой мужчина женился на женщине, имеющей нормальный слух. Можно ли определить генотип матери ребёнка?
Задача №7. Из желтого семени гороха получено растение, которое дало 215 семян, из них 165 желтых и 50 зелёных. Каковы генотипы всех форм?
Задача№8. Отец и мать ощущают горький вкус фенилтиомочевины. Двое из четверых детей не чувствуют вкуса этого препарата. Принимая, что различия по чувствительности к фенилтиомочевине моногенны, определите доминантна или рецессивна нечувствительность к фенилтиомочевине.
Окраска по Граму.
1 этап - приготовление мазка.
Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.
2 этап - высушивание.
Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.
3 этап - фиксация.
Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.
4 этап - окраска.
Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристаллвиолетом (3-5 минут), а сложных - окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.
Дифференцирующий метод Грама
После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+). другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.
Этапы окраски по Грамму